拉里生活似乎不太顺利，经常换工作居无定所，妻子与他离婚，找了一个证券经纪人即将再婚，自己在儿子心目中的地位也岌岌可危，妻子也因为他不稳定的工作，劝他放弃儿子的抚养权。
拉里为了挽救自己的生活，也为了争取到儿子的抚养权，他不得不放弃做大事的梦想，成为了纽约自然博物馆的夜间警卫。拉里原本以为这是一份无聊的工作。
谁知道上班的第一天不可思议的事情就发生了，在和三个前任夜班看守员交接之后。拉里开始了他第一次的博物馆夜巡之旅。
博物馆里的法老金牌拥有神奇的魔法，当夜晚来临的时候，馆中所有的标本都会活过来，追逐骨头的霸王龙、爱捣乱的猴子，暴虐的匈奴王、钻木取火的穴居人，将一切弄得不可开交。
在26任总统特迪罗斯福的帮助下。
达利好不容易控制住了局面，还好被路过的美国总统罗斯福救下，拉里在罗斯福的介绍下知道了这座神奇博物馆的秘密。原来博物馆的人物之所以可以在夜晚复活，都是因为法老馆内的一块黄金九宫格板。
只要这个黄金格板存在每到晚上的12点过后，博物馆内的所有生物都会复活。而随着清晨第一缕阳光的射入博物馆又会恢复平静。
知这一情况的拉里虽然想放弃这份工作，但因为儿子抚养权的问题不得不硬着头皮干下去，拉里只得恶补历史知识以应付晚间的看守工作。
临时抱佛脚的拉里再次在夜间进入这座神奇的博物馆，却又遭到突发情况看着一片狼藉的博物馆让馆长大发雷霆，他甚至要开除拉里沮丧的拉里都要放弃了却突然想到罗斯福对他说的。
你是守夜者这个机构里最值得尊敬的人，这次拉里还叫上了自己的儿子一起看守。
却突然发现给予馆内生物生命的黄金九宫格板，被三个前任夜班看守员偷盗，被贪婪支配的三人在得知自己要离开时，就箫划偷走这块神奇的黄金格板。
眼看三个前任分头逃走。而拉里父子则是号召馆内的所有生物，顺利抓捕到了两名前任看守员。拉里命微型罗马人和西部牛仔驾车吸引恐龙。
让恐龙阻止最后一个坏蛋的逃离三个偷盗的罪犯都被抓到，拉里在黄金格板主人的帮助下按时将所有生物送回。
由于夜晚馆内生物的大量出行引起了广泛的社会报道，使得原本接待清冷的博物馆迎来了事业的第二春。拉里也顺利的留在博物馆内继续他的神奇夜间之旅。